一、引言

　　納米技術(shù)(nanometer technology)主要是針對(duì)尺度為1nm~100nm之間的分子世界的一門技術(shù)。該尺寸處在原子、分子為代表的微觀世界和宏觀物體交界的過(guò)渡區(qū)域，基于此尺寸的系統(tǒng)既非典型的微觀系統(tǒng)亦非典型的宏觀系統(tǒng)，因此有著獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)，如表面效應(yīng)、微尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等。

　　納米技術(shù)引入生物傳感器領(lǐng)域后，提高了生物傳感器的檢測(cè)性能，并促發(fā)了新型的生物傳感器。因?yàn)榫哂辛藖單⒚椎某叽�、換能器、探針或者納米微系統(tǒng)，生物傳感器的化學(xué)和物理性質(zhì)和其對(duì)生物分子或者細(xì)胞的檢測(cè)靈敏度大幅提高，檢測(cè)的反應(yīng)時(shí)間也得以縮短，并且可以實(shí)現(xiàn)高通量的實(shí)時(shí)檢測(cè)分析。本文就納米技術(shù)在生物傳感器中的應(yīng)用作一介紹，包括多種納米結(jié)構(gòu)的性能和制作。

　　二、納米結(jié)構(gòu)

　　納米結(jié)構(gòu)在生物傳感器中應(yīng)用非常廣泛，納米結(jié)構(gòu)可以是管道、纖維、顆粒、光纖以及薄膜和多孔體等。下面就不同納米結(jié)構(gòu)在生物傳感器中應(yīng)用分別進(jìn)行介紹。

　　1、納米顆粒在生物傳感器中的應(yīng)用

　　關(guān)于納米顆粒的研究很多，例如將功能性納米顆粒(如電子性質(zhì)的、光學(xué)性質(zhì)的和磁性的)固定在生物大分子(如多肽、蛋白、核酸)上，可制成用于生物信號(hào)檢測(cè)、信號(hào)轉(zhuǎn)換和放大的傳感器，其可分為聲波、光學(xué)、磁性和電化學(xué)等種類。

　�。�1）聲波生物傳感器

　　聲波生物傳感器是檢測(cè)待檢測(cè)物質(zhì)引起聲波頻率改變的傳感器。其中，被研究最多的是石英晶體微天平(quartz crystal microbalance, QCM)生物傳感器。其壓電晶體常用AT方式(AT切割指切割面與石英晶體主光軸成25.15°，此刻，在室溫下晶體共振溫度系數(shù)接近于零)，在晶體的兩面則采用離子束沉積等方法形成兩個(gè)平行金屬 (Au，Ag，Pt，Ni，Pd等)膜電極。膜電極的表面固定識(shí)別分子，識(shí)別分子因其有特異性而結(jié)合待檢測(cè)分子，引起電極表面的質(zhì)量變化，從而改變石英晶體的振蕩頻率。如果在待檢測(cè)分子上修飾納米顆粒，會(huì)顯著提高待檢測(cè)分子的質(zhì)量，則檢測(cè)信號(hào)也隨之增強(qiáng)。Ward[1]等人用納米膠顆粒標(biāo)記抗體，通過(guò)抗體－抗原免疫方法將其結(jié)合到石英晶體表面，由于修飾膠體顆粒(溶膠顆粒的直徑在5~100nm)提高了標(biāo)記分子的質(zhì)量，根據(jù)Sauerbrey方程，石英晶體的振蕩頻率也相應(yīng)得以提高，因而檢測(cè)信號(hào)被放大，檢測(cè)靈敏度提高，檢測(cè)下限也降低了。

　　（2）光學(xué)生物傳感器

　　納米金屬顆�？梢杂糜诠夤舱駲z測(cè)，Bauer[2]等人通過(guò)抗原－抗體或蛋白－受體結(jié)合等方法在導(dǎo)電材料表面固定納米金屬顆粒團(tuán)，由于納米顆粒反射偶極子的相互作用，引起反射光的共振增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)共振信號(hào)即可探知待檢測(cè)物質(zhì)。納米顆粒也可以用來(lái)定位腫瘤，熒光素標(biāo)記的識(shí)別因子與腫瘤受體結(jié)合，然后在體外用儀器顯示出腫瘤的大小和位置。

　　納米金屬顆粒還可以作為一種通用的熒光湮滅基團(tuán)。Maxwell[3]等人在寡核甘酸探針?lè)肿拥膬啥朔謩e標(biāo)記納米金顆粒和熒光激發(fā)基團(tuán)，探針由于堿基互補(bǔ)形成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)，熒光激發(fā)基團(tuán)和納米金顆�？拷�，引起激發(fā)熒光湮滅；而當(dāng)探針與特異性靶DNA結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生變化，納米金顆粒和熒光激發(fā)基團(tuán)分離，從而激發(fā)出熒光。該原理可用于核酸的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，以及單堿基突變多態(tài)性檢測(cè)等。

　�。�3）磁性生物傳感器

　　磁性納米顆粒在生物檢測(cè)和藥物分析上有著重要的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)磁性材料標(biāo)記生物分子，結(jié)合分子識(shí)別技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)樣品的混合、分離、檢測(cè)等復(fù)雜操作。Šafařík和Šafaříková[4]Richardson等人通過(guò)磁免疫分析技術(shù)，用磁力計(jì)數(shù)器檢測(cè)磁性標(biāo)記分子。另外，用納米磁性顆粒標(biāo)記識(shí)別因子，與腫瘤表面的靶標(biāo)識(shí)別器結(jié)合后，可在體外測(cè)定磁性顆粒在體內(nèi)的分布和位置，從而給腫瘤定位。等人用磁性材料標(biāo)記分子，在磁場(chǎng)梯度下實(shí)現(xiàn)樣品的分離和檢測(cè)。

　　Chemla[6]等人利用順磁性的納米顆粒和基于高溫瞬態(tài)直流超導(dǎo)量子界面裝置(superconducting quantum interference device，SQUID)的顯微鏡，提出了一種新穎的生物樣品的快速檢測(cè)技術(shù)。首先，把固定抗體的磁性顆粒懸浮在溶液中，然后在瞬時(shí)磁場(chǎng)脈沖下，磁化納米顆粒產(chǎn)生，當(dāng)磁場(chǎng)消失時(shí)，顆粒趨向自由分布，因?yàn)闆](méi)有結(jié)合抗體的顆粒呈布朗運(yùn)動(dòng)，所以沒(méi)有檢測(cè)信號(hào)；而結(jié)合靶分子的納米顆粒按照Neel松弛方式運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生一個(gè)緩慢衰減的磁信號(hào)，通過(guò)SQUID采集的信號(hào)即可分析出待檢測(cè)物質(zhì)。該技術(shù)無(wú)需分離未結(jié)合待檢測(cè)分子的納米顆粒，可以直接檢測(cè)標(biāo)記分子，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

　�。�4）電化學(xué)生物傳感器

　　膠體金是最常見(jiàn)的金屬納米顆粒，可以用于生物分子的標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)和放大；此外，它還可廣泛應(yīng)用于TEM、SEM表征和試紙條顯色等方面。許多文獻(xiàn)也報(bào)道了膠體金在各種生物傳感器中的信號(hào)放大作用。Gonzalez-Garcia[7]等人利用膠體金標(biāo)記，結(jié)合電化學(xué)方法來(lái)研究生物素—親和素之間的作用。通過(guò)把生物素化的白蛋白修飾在電極表面，然后與10nm直徑膠體金標(biāo)記的親和素反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)由膠體金引起的電流響應(yīng)和親和素濃度線性相關(guān)(2.5×10-9mol/L ~2.5×10–5mol/L)。

　　納米粒子具有極佳的比表面積，可用于生物分子的固定，能增加固定的分子數(shù)量，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大。Singh等人用sol-gel方法合成硅納米顆粒，其直徑為20nm或200nm。在納米顆粒表面固定乙酰膽堿脂酶，可用于制造有機(jī)磷農(nóng)藥生物傳感器，由于具有較高的比表面活性，結(jié)合離子敏場(chǎng)效應(yīng)管檢測(cè)，響應(yīng)迅速(<10s)，靈敏度高，對(duì)paraoxon殺蟲劑的檢測(cè)下限可達(dá)1×10-6mol/L。Cai[8]等人把膠體金納米顆粒固定在胱氨酸修飾的金電極表面，增加了ssDNA探針的固定效率，提高了檢測(cè)的靈敏度。

　　金屬納米顆粒作為催化劑的載體，可以大大提高催化劑的性能。酶－膠體金固定在電極表面，可用于H2O2、葡萄糖、黃嘌呤、次黃嘌呤等電化學(xué)檢測(cè)。Xu[9]等人在絲網(wǎng)印刷的碳電極表面用膠體金修飾，結(jié)合免疫結(jié)合山葵過(guò)氧化酶(HRP)制作H2O2生物傳感器，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRP的電催化性能和電流響應(yīng)顯著改善，信號(hào)線性范圍有了很大的提高(0.8μM~1.0mM)，檢測(cè)下限也降低至0.4μM。

　　2、納米導(dǎo)線

　　采用攙硼硅(silicon nanowires，SiNWs)制作而成的納米導(dǎo)線，可以提高生物傳感器的電化學(xué)檢測(cè)靈敏 度。Cui[10]等人用胺和羥基修飾SiNWs，制作成納米PH計(jì)。由于導(dǎo)線表面修飾基團(tuán)在溶液中的質(zhì)子化和去質(zhì)子化，引起導(dǎo)線的電導(dǎo)率改變，而導(dǎo)線的電導(dǎo)率與溶液的PH值呈線性關(guān)系，因此可以探測(cè)環(huán)境中的PH測(cè)量。另外，Cui等人用生物素修飾的SiNWs可以檢測(cè)到pmol濃度的鏈霉素抗生物素蛋白。固定抗原的SiNWs還可用于抗體的可逆結(jié)合和實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。研究表明，半導(dǎo)體的納米導(dǎo)線可以制作高靈敏度、無(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)檢測(cè)的生物傳感器及其陣列。

　　3、納米微管和多孔納米結(jié)構(gòu)

　　微管和多孔結(jié)構(gòu)可以保持生物分子的活性和提高分子的固定效率，而采用尺寸更小、比表面積更大的納米微結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)一步改善生物傳感器的性能。

　�。�1）納米微管

　　納米微管的研究報(bào)道很多，其中，以碳納米管的研究最熱。碳納米管有著優(yōu)異的表面化學(xué)性能和良好的電學(xué)性能，是制作生物傳感器的理想材料。無(wú)論是單層碳納米管(single-wall nanotubes，SWNT)還是多層碳納米管(multi-wall nanotubes，MWNT)在生物傳感器中都有應(yīng)用。與常規(guī)的固態(tài)碳傳感器相比，碳納米管制作的生物傳感器的靈敏度高、反應(yīng)速度快，檢測(cè)溫度范圍廣。據(jù)報(bào)道，Azamian等人[11]SWNT表面固定葡萄糖氧化酶，使酶的催化活性比普通碳電極固定的酶的催化活性提高1個(gè)數(shù)量級(jí)。K. Aihara[12]等人制作了微波碳納米管電磁共振生物傳感器，用于氣體和生物分子的靈敏檢測(cè)。他們將長(zhǎng)3μm～10μm直徑1.4nm～25nm的SWNTs固定在微加工的電磁共振器的表面，在不同的有機(jī)氣體環(huán)境中，共振器表面吸收有機(jī)氣體引起共振頻率改變，例如，異丙醇(IPA)使傳感器的共振頻率遷移2MHz～3MHz；而當(dāng)恢復(fù)原來(lái)氣體環(huán)境時(shí)，傳感器的共振頻率逐漸恢復(fù)。曾在
Miao[13]等人發(fā)現(xiàn)了一種聚吡咯(polypyrrole)納米微管。利用化學(xué)或電化學(xué)方法使吡咯單體在模板孔隙中生長(zhǎng)，可得到與模板相應(yīng)結(jié)構(gòu)的納米管。這種微管具有統(tǒng)一直徑、上下連通、管壁多孔的特點(diǎn)。它具有較大的比表面積，能容納大量的酶分子，并減少反應(yīng)物和產(chǎn)物的擴(kuò)散障礙，有效地提高酶電極的性能。

　�。�2）納米多孔硅

　　對(duì)單晶硅進(jìn)行電化學(xué)腐蝕可以得到具有納米孔徑的多孔硅，這種材料在室溫下可發(fā)射可見(jiàn)光，具有高比表面積 (500m2/cm3)以及與現(xiàn)有硅加工技術(shù)相容等優(yōu)點(diǎn)。前一優(yōu)點(diǎn)增加了可固定敏感分子的數(shù)量，從而提高了靈敏度，后一優(yōu)點(diǎn)則便于各種形式的微加工和大規(guī)模生產(chǎn)。在多孔硅的表面固定寡核苷酸、生物素或者抗體等識(shí)別分子，通過(guò)檢測(cè)光干涉和折射率的變化，從而能構(gòu)建一種新型的免標(biāo)記生物傳感器[14]cDNA的檢測(cè)，靈敏度可達(dá)194. 2fmol/L。。其可用于
 
　　4、光纖納米生物傳感器

　　與其它類型的生物傳感器相比，光纖納米生物傳感器非但體積微小、靈敏度高，而且不受電磁場(chǎng)干擾，不需要參比器件。它可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞質(zhì)的變化進(jìn)行在線體測(cè)量。

　�。�1）光纖納米熒光生物傳感器

　　Kopelman[15-16]最早使用了熒光法的光纖納米傳感器，以檢測(cè)微環(huán)境中的PH值。其工作原理是在光纖頭部固定熒光劑，在熒光劑與質(zhì)子發(fā)生可逆反應(yīng)時(shí)，液體光學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化即可測(cè)定PH值。光纖處理的方法如下：用光纖拉制儀將光纖拉制成頭部直徑為100nm~1000nm的光纖探針，用真空蒸發(fā)器在光纖表面鍍上鋁，以防止光在傳輸過(guò)程中外泄，然后將暴露的光纖頭部硅烷化，表面修飾成含羥基或氨基的活性表面，固定識(shí)別待檢測(cè)分子的抗原或抗體，最后在光纖頭部結(jié)合上一種PH選擇性熒光染料聚合物。該納米傳感器響應(yīng)時(shí)間為250ms，可以檢測(cè)濃度為μM的離子。這些特性適宜于對(duì)單個(gè)細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的檢測(cè)，例如進(jìn)行小鼠胚胎細(xì)胞液PH值的檢測(cè)。

　�。�2）光纖納米免疫生物傳感器

　　光纖納米免疫傳感器是將光學(xué)與光子學(xué)技術(shù)應(yīng)用于免疫法，利用抗原抗體能發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，將感受到的抗原量或抗體量轉(zhuǎn)換成光學(xué)信號(hào)的一類傳感器，這類傳感器集傳統(tǒng)的免疫測(cè)試法與光學(xué)、生物傳感技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)集一身，具有很高的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。同時(shí)，光纖納米免疫傳感器只是在將敏感部件上使用了納米產(chǎn)品，因此既保留了原來(lái)的諸多優(yōu)點(diǎn)，又使之能適用于單個(gè)細(xì)胞的測(cè)量。Dinh[17-18]等人成功地研制出一種用于檢測(cè)BPT(Benzo pyrene tetrol，是一種與暴露于致癌物質(zhì)苯并[α]芘相關(guān)的DNA損傷的生物標(biāo)志物)的光纖納米免疫傳感器。他們首先用光纖拉制儀制作直徑10nm~100nm的石英光纖，然后將光纖頭部硅烷化，并用BPT的抗體修飾光纖頭部，隨后將光纖全長(zhǎng)(修飾的光纖頭部除外)鍍銀以防止光漏出，最后在單細(xì)胞操作的顯微操縱儀/顯微注射器上進(jìn)行細(xì)胞穿刺及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，用光電倍增管PMT記錄BPT與抗體結(jié)合后產(chǎn)生的熒光，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)BPT的含量。該傳感器的最低檢出限可以達(dá)到10 –21mol。

　　5、納米微加工

　　納米微加工技術(shù)融合了IC工藝和MEMS工藝，主要包括光刻、薄膜的生長(zhǎng)/淀積、離子注入、腐蝕和鍵合等四個(gè)加工步驟。近年來(lái)，分子自組裝成為微細(xì)加工發(fā)展的新方向。
L. Malaquin[19]等人采用電子束光刻工藝制作納米電極。在光滑的硅襯底材料上，用電子束曝光、剝離(Lift-off)等工藝制作出金納米電極結(jié)構(gòu)，最小線寬可以達(dá)到20nm。該納米電極可用于直徑為100nm膠體金的電化學(xué)檢測(cè)。

　　IBM公司和瑞典Basel[20]大學(xué)的研究人員正在開(kāi)發(fā)一種新型的納米微懸梁生物傳感器，利用DNA分子的雙螺旋機(jī)構(gòu)作為分子特異性識(shí)別能力的模型。器件的核心是硅懸梁天平陣列，長(zhǎng)500μm，寬100μm，厚度為1μm。當(dāng)生物分子結(jié)合時(shí)，懸梁臂開(kāi)始彎曲，通過(guò)激光反射技術(shù)， 10nm~20nm的彎曲都能被檢測(cè)到。在懸梁天平陣列表面固定具有不同識(shí)別性的分子，構(gòu)成陣列式生物傳感器，可以同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)。

　　美國(guó)Naval[21]研究實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步改進(jìn)了懸臂梁生物傳感器，提出了磁力放大生物傳感器(force amplified biological Sensor, FABS)的概念。通過(guò)待測(cè)樣品分子免疫結(jié)合微磁珠，在懸臂梁的垂直方向引入磁場(chǎng)，微磁珠由于受到磁力作用，引起懸梁臂的彎曲。由于用力量較大的磁場(chǎng)力代替原來(lái)較弱的重力，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到10-18M。

　　三、結(jié)束語(yǔ)

　　納米技術(shù)和生命科學(xué)是21世紀(jì)最前沿的兩大學(xué)科，納米技術(shù)的介入為生物傳感器的發(fā)展提供了無(wú)窮的想象空間�？偟恼f(shuō)來(lái)，納米顆�？梢詮V泛地應(yīng)用于敏感分子的固定(納米金、碳納米管)、信號(hào)的檢測(cè)和放大 (納米金、納米磁粒子、熒光納米顆粒)、待側(cè)物質(zhì)的富集和濃縮(納米磁粒子)。由于納米結(jié)構(gòu)有著優(yōu)異的化學(xué)和物理性能，有著極高的比表面，有利于提高敏感分子的吸附能力，并能提高生化反應(yīng)的速度，因此被廣泛用于生物傳感器表面吸附層的制作，例如表面薄膜共振SPR檢測(cè)的等離子共振的金膜，氣體傳感器中催化劑固定的碳納米管以及懸臂梁結(jié)構(gòu)中提高吸附性能的納米膜等。此外，利用納米結(jié)構(gòu)的特性，可以制作全新的生物傳感器。實(shí)際上，生物分子本身就可以看作具有特定功能的納米器件，如酶分子對(duì)底物分子的識(shí)別和作用，它可以切斷底物分子的化學(xué)鍵并進(jìn)行重組。細(xì)菌視紫紅質(zhì)的蛋白質(zhì)對(duì)光很敏感，當(dāng)它暴露于光下時(shí)會(huì)發(fā)射出質(zhì)子，從而產(chǎn)生出可以檢測(cè)的微小電信號(hào)。它對(duì)特定頻率光的響應(yīng)受溶液中不同離子濃度的影響，因而可以用來(lái)檢測(cè)離子。

　　納米技術(shù)在生物傳感器的發(fā)展趨勢(shì)是集成多功能、便攜式、一次性的快速檢測(cè)分析機(jī)器，可廣泛用于食品、環(huán)境、戰(zhàn)場(chǎng)、人體疾病等領(lǐng)域的快速檢測(cè)，如食品和飲料中病原體或者農(nóng)藥殘留成分的快速靈敏檢測(cè)，環(huán)境中污染氣體或者污染金屬離子等遠(yuǎn)程檢測(cè)和控制，人體血液成分和病原體的快速實(shí)時(shí)檢測(cè)，人體健康的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)(如糖尿病患者血液中糖成分的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)等)，以及戰(zhàn)場(chǎng)生化武器的快速檢測(cè)(如對(duì)炭疽病毒的檢測(cè)等)。

　　多種生物傳感器的集成或者生物傳感器陣列是生物傳感器發(fā)展的另一個(gè)趨勢(shì)，例如微電極陣列對(duì)二維微環(huán)境的檢測(cè)等。分子自組裝聚合物加工的研究呈上升趨勢(shì)，其加工工藝簡(jiǎn)單可控，可以實(shí)現(xiàn)快速?gòu)?fù)制，而且成本較低，對(duì)生物傳感器的發(fā)展有很重要的促進(jìn)作用，有利于高靈敏度、低成本、一次性的納米生物傳感器的發(fā)展。 其中生物分子自組裝技術(shù)更引人注目，如有機(jī)生物膜制作的納米膠囊，由于其天然的生物兼容性、優(yōu)異的特異結(jié)合性能，是生物傳感器發(fā)展的另一個(gè)全新領(lǐng)域。

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